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单克隆抗体的制备过程_单克隆抗体的应用现状及前景

来源:医学论文 时间:2019-03-20 点击: 推荐访问:病理单克隆抗体检测

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摘要:自单克隆抗体技术创建以来,由于产生单一抗体的特异性和高纯度已被广泛的应用于医学临床、生物技术、农业、食品等领域。文章阐述了单克隆抗体的制备技术,从多个角度介绍了单克隆抗体的应用情况,并对其缺点及发展前景做了介绍。
  关键词:单克隆抗体;制备;应用;前景
  中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2013)-04-0059-2
  1975年Kohler和Mrilsteln等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体(Monoclone antibodies,McAb),简称单抗。单抗是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合,通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯的单克隆细胞系而产生的。[1]
  1 单抗的制备
  用特定的抗原刺激正常小鼠的B淋巴细胞会产生相应单一特异性抗体,但这种细胞难以在体外培养。骨髓瘤细胞可以在体外培养生长,而且比正常细胞生长繁殖的速度要快。但这种细胞不会产生抗体。利用杂交瘤技术可以将这两种各具功能的细胞融合在一起,培养成既能产生单一抗体,又能在体外快速生长的杂交瘤细胞。[2]单克隆抗体的制备全过程主要分为三个阶段:免疫小鼠;建立筛选方法和程序;杂交瘤生成。通过多次筛选最终选出最优细胞,从而分泌出最优抗体。
  2 单抗的应用
  2.1 生物导弹
  肿瘤治疗的放序和化序都是针对某一部位的所有细胞,包括肿瘤细胞和正常细胞。所以癌症者在接受治疗时杀死肿瘤细胞的同时也将许多正常细胞杀死,甚至会诱导正常细胞发生基因突变,从而产生巨大的副作用。如将患者体内肿瘤细胞的抗原提取出来制成相应的单抗,再将单抗与化序药物结合到一起,利用抗体与抗原特异性结合原理将化序药物定向地带向肿瘤细胞并将其杀死,则有利于大大减少其治序中的副作用,提高治疗效果和降低治疗花费。通过临床前的体内、外试验,以及制备异体移植肿瘤模型等,证实单克隆抗体可直接对抗血管内皮生长因子,抑制肿瘤的生长,并使肿瘤的微血管密度(MVD)明显降低,起到针对肿瘤细胞的“生物导弹”作用。
  2.2 蛋白质提纯
  先用待提纯蛋白质制成单抗,再将单抗固定在惰性固相基质上,制成层析柱。而后倒入混合液,当混合液流经单抗时,相应的蛋白质与单抗特异性结合,杂质则随洗脱剂流走。再用特殊的洗脱剂将蛋白质洗脱下来,则可将蛋白质提纯。
  2.3 作为免疫抑制剂
  单克隆抗体作为免疫抑制剂在抗器官移植排斥反应和在治疗自身免疫性疾病中具有广泛的应用。排斥反应在器官移植中是非常致命的。器官的移植是否成功就取决于是否会发生排斥反应以及排斥反应的强度。而单抗能够有效地抑制相应的淋巴细胞的作用从而可以抑制或减轻排斥反应的发生。急性移植抗宿主病是同种异体骨髓移植的巨大障碍,单克隆抗体技术的成功为器官移植和自身免疫性疾病的治疗带来了福音。
  2.4 增强免疫原性
  自1984年以来,Celis等发现抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖,并可诱生干扰素。疫苗的接种都存在一定风险,尤其是刚出生的小孩,免疫能力很差,免疫系统不成熟,如接种疫苗量过大则容易引发事故。将单抗制成佐剂加在疫苗里,则可减少疫苗接种时药物的用量和避免多次接种并不能引起机体更好地产生免疫应答,从而减少疫苗接种的风险。
  2.5 临床诊断
  通过提取患者体内病变组织制成装片,再用已知单抗与其反应,根据两者之间是否能发生反应,则可确定其致病因子。给后期的治序提供准确的方向,从而能达到更好、更快、更安全治序的目的。
  2.6 农兽药快速检测[3]
  农兽药属于小分子物质,是一种半抗原,无免疫原性,不能刺激动物产生抗体,必须先将其通过一定长度的碳链连接分子与大分子量载体(一般为蛋白质)以共价键相偶联制备成人工抗原后,以人工抗原免疫动物,使动物的免疫系统发生应答反应,从而制备出对该农药具特异性的多或单克隆抗体。使用McAb技术使得制备高特异性的抗体成为可能,国外已制备多种农兽药单克隆抗体并应用于农药和兽药残留的免疫分析。
  3 单抗的缺点
  3.1 排斥反应[4]
  单克隆抗体技术研制成功后在临床应用方面进展缓慢,主要原因是目前绝大多数单克隆体为鼠源性,因此对人体仍有较强的免疫原性,用后可产生人抗鼠抗体。所以当单抗注入人体后,鼠源单抗在人体中常不能有效激活不提和Fc受体相关的效应系统,破人体免疫系统所识别,引发机体的免疫应答,使单抗的组成结构发生了改变,产生抗鼠抗体,从而影响其功能,大大降低了单抗治序效果,甚至会被机体直接当成异物清除。因此,鼠源性单克隆抗体还应改善才能应用于临床。
  3.2 靶吸收差
  单克隆抗体为完整的抗体分子,相对分子量很大,很难通过血管进入细胞间隙。因为毛细血管壁由两层细胞组成,单克隆抗体要想通过血管进入组织细胞必须经过四层细胞膜,而细胞膜只允许小分子物质通过,大分子物质想通过细胞膜特别困难。所以使用单克隆抗体治疗时,能够到达靶部位的单抗量特别少,从而大大降低了治疗效果。
  3.3 生产周期长,成本高
  由于传统制备单抗的方法步骤多而繁琐,在单抗的提纯时技术含量要求高。一般要花费6个月以上的时间才能制备完成,对于生产企业来说耗时长,成本高,经济效益低。
  3.4 变态反应
  变态反应是指在输注单抗药物时会使患者产生一些像胸闷、心悸、心电监护显示连发房性早搏等不良反应。变态反应为利妥昔单抗药物最常见的不良反应。夏忠军等[5]进行的临床研究:确诊惰性淋巴瘤的患者接受利妥昔的方案化疗,结果总有效率为92.3%,完全缓解率为60%。主要不良反应为骨髓移植,其他不良反应包括恶心呕吐、轻度脱发和肝功能受损等。其中变态反应一般在输药后30min~2h内发生。   4 单抗的发展前景
  4.1 全人源化单抗
  自杂交瘤技术问世以来,单克隆抗体已广泛应用。但绝大多数单克隆抗体是鼠源的,临床重复给药时体内产生抗鼠抗体,使临床疗效减弱或消失。因此,临床应用理想的单克隆抗体应是人源的。因此,可以利用基因工程以及基因治序技术将小鼠受精卵中控制脾脏生成的基因剪切掉,再将人体细胞中控制人脾脏生成基因提取出来转入小鼠受精卵中,待受精卵发育成成鼠后,小鼠体内脾脏产生的抗体则是全人源抗体。此技术具有良好的发展和应用前景。
  4.2 高靶向性[6]
  单克隆抗体药物治疗主要是利用其靶向性,来干预目标细胞的发生发展过程的各个通路,或是激活宿主对肿瘤的免疫等,因此,靶点是研究不同种类抗体药物的关键。随着生物医学的不断发展,一定会出现具有更高靶向性的单抗和药效更强的“弹头”。
  4.3 临床诊断及检测
  单克隆抗体在传染病、免疫性疾病、内分泌性疾病的诊断和早孕诊断方面,大大优于现有的抗血清。如当今艾滋病已成为人类一大“杀手”,传播速度相当快,并在人体内有一定潜伏期,患者没有任何反应,从而耽误了最佳治疗时期。如将艾滋病毒提取出来制成单抗,并将单抗制成PH试纸一样大小的卡片。所以只要把一个小卡片放在口里就可以检测出是否患有艾滋病。这样则可很好地预防和检测艾滋病以及使患者能更早地接受治疗。
  4.4 终生免疫
  将对抗某一抗原的单抗通过蛋白质工程技术推出控制相应单抗合成的DNA片段,再将相应DNA片段通过基因治疗技术转入人体内,然而此DNA片段能随体细胞复制表达,使人体内终身含有相应的抗体抵抗相应病原体。
  参考文献
  [1] 王俊丽,聂国兴.生物制品学[M].科学出版社,2008:338-343.
  [2] 周东坡,赵凯等.生物制品学[M].化学工业出版社,2007:
  54.
  [3] 马巍娜.单克隆抗体技术用于农兽药快速检测的研究进展[J].现代生物医学进展,2007 1911-1913.
  [4] 孔君,刘箐等.单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景.免疫学杂志[J].2011,279(2)70-173.
  [5] 夏忠军等.含美罗华方案治疗B细胞性惰性淋巴瘤34例报告[J].癌症,2006,25(4):490-494.
  [6] 刘宇良等.单克隆抗体再治疗癌症方面的研究进展.南昌大学学报[J].2011年第51卷9期100-102.

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